Esistono diverse tecniche analitiche per la determinazione di potenziali allergeni negli alimenti. Alcune vanno a identificare direttamente l’allergene, altre un marcatore che ne indichi la presenza, ma tutte presentano problematiche comuni legate all’estrazione del determinante allergenico, operazione sulla quale incide inevitabilmente il tipo di lavorazione cui è stato sottoposto l’alimento.
Uno studio approfondito di sviluppo e di validazione è fondamentale per individuare la tecnica più adatta e i metodi di estrazione più efficaci per ciascuna matrice alimentare.
I metodi più comuni per la determinazione degli allergeni alimentari sono:
- ELISA
- RT PCR
- LC-MS/MS
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA è la tecnica più comunemente adottata per effettuare analisi di routine degli allergeni alimentari.
Seppur con alcune varianti, la tecnica ELISA determina direttamente la proteina allergenica e l’epitopo utilizzando anticorpi specifici che formano un complesso stabile con il determinante allergenico.
Il metodo ELISA è quantitativo, accurato, sensibile e può essere applicato a diverse matrici, quali alimenti, materie prime, ingredienti, acque di processo e tamponi.
Nei cibi altamente trasformati la proteina target può subire una parziale denaturazione a causa dello stress termico. In questo caso è fondamentale valutare in modo accurato e scientifico la reattività e la prestazione dei diversi kit ELISA disponibili in commercio, in quanto sono diverse le variabili che possono incidere su denaturazione, aggregazione e allergenicità della proteina.
Talvolta potrebbe essere necessario scegliere approcci alternativi.
RT PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction)
PCR è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per generare migliaia, o addirittura milioni, di copie (in gergo “amplificare”) di piccoli frammenti specifici di DNA.
Sebbene ELISA rimanga la tecnica più usata nel testing di routine degli allergeni alimentari, molti protocolli si basano sulla tecnica della PCR.
RT PCR identifica il DNA che produce la proteina allergenica. Per questo motivo si parla di “metodo indiretto” per la determinazione di allergeni, in quanto la tecnica non identifica direttamente la proteina allergenica, bensì la “specie” (il DNA) da cui la proteina è generata.
Si tratta di un metodo specifico e sensibile consistente nell’amplificazione del DNA mediante l’utilizzo di primer specifici. La reazione viene ripetuta per diversi cicli permettendo nel tempo un’amplificazione esponenziale dei frammenti di DNA (Mullis et al., 1992). Al termine della RT PCR i frammenti di DNA amplificati vengono rilevati e quantificati.
Per minimizzare il rischio di presenza di allergeni negli alimenti, è consigliabile combinare insieme le tecniche RT PCR ed ELISA, in quanto forniscono risultati complementari.
LC-MS/MS (Liquid Chromatography and Mass Spectrometry)
Negli ultimi anni il metodo LC-MS/MS ha giocato un ruolo sempre più centrale nel testing degli allergeni alimentari. La tecnica combina l’elevato potere risolutivo della Cromatografia Liquida (LC) con la specificità e la sensibilità della Spettrometria di Massa (MS/MS).
In questo tipo di analisi le proteine allergeniche vengono normalmente digerite da enzimi specifici in peptidi più piccoli, più semplici da gestire. La cromatografia liquida isola i peptidi target dalla matrice alimentare, mentre la spettrometria di massa li identifica e li quantifica grazie alla peculiare capacità di distinguere le molecole sulla base delle loro proprietà intrinseche. In questo modo, gli allergeni possono essere quantificati direttamente, indipendentemente dalla loro conformazione.
Per queste sue caratteristiche, LC-MS/MS è un metodo particolarmente affidabile anche per determinare la presenza di allergeni alimentari in cibi altamente trasformati.
